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Techniques de conservation post-recoltes : cas de l’inhibition de la croissance et de la production d’aflatoxines chez aspergillus sp


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Maîtrise des Procédés en vue d’améliorer la qualité et la sécurité des aliments, Utilisation des OGM, Analyse des risques en agroalimentaire.Ouagadougou, 8-11 Novembre 2005.



TECHNIQUES DE CONSERVATION POST-RECOLTES : CAS DE L’INHIBITION DE LA CROISSANCE ET DE LA PRODUCTION D’AFLATOXINES CHEZ ASPERGILLUS SP.
Pane Bernadette Ouattara/ Sourabié1*, Philippe Augustin Nikiema1, Alfred S. Traoré1
1- Centre de Recherche en Sciences Biologiques Alimentaires et Nutritionnelles (CRSBAN) - Département de Biochimie / Microbiologie - Unité de Formation et de Recherche en Science de la Vie et de la Terre (UFR/SVT) -Université de Ouagadougou 03 BP 7131 Ouagadougou 03, Burkina Faso

* Auteur correspondant : Pane_sourabie@univ-ouaga.bf; b_sourabie@yahoo.fr


Mots Clés : Aspergillus ; aflatoxines ; cancer du foie ; conservation ; inhibition.

1. RESUME
La conservation post-récolte occupe une place importante dans l’atteinte de l’autosuffisance alimentaire des pays en voie de développement comme le Burkina Faso. En effet, les champignons toxinogènes tels que Aspergillus flavus et A. parasiticus contaminent les récoltes et y produisent des aflatoxines qui sont reconnues cancérigènes pour l’homme et les animaux. Ces champignons provoquent ainsi une perte de la valeur nutritive et commerciale des récoltes.L’une des voies de lutte contre les champignons toxinogènes est l’utilisation de plantes fongicides ou fongistatiques. La présente étude s’est intéressée à l’inhibition de la croissance et de la production d’aflatoxines chez une souche d’Aspergillus sp.Il est ressorti à l’issue de ce travail que la souche isolée, purifiée et caractérisée est productrice des aflatoxines B1, B2, G1 et G2 et peut être classée provisoirement comme appartenant à l’espèce Aspergillus parasiticus. Les propriétés fongistatiques de Hyptis spicigera, Hyptis suaveolens et Cassia nigricans ont été démontrées. Les extraits de ces plantes ont été utilisés pour inhiber la croissance et la capacité de production des aflatoxines chez la souche isolée. Cette croissance a été inhibée de 43% par Hyptis spicigera. La même plante a également diminué la production de l’aflatoxine G1 de 45% et de la B1 de 7%.
2. INTRODUCTION
Les aflatoxines sont des métabolites secondaires des moisissures telles Aspergillus flavus et A. parasiticus. Celles-ci contaminent les récoltes lorsque les conditions climatiques sont favorables, abaissant ainsi leur valeur nutritive en produisant des mycotoxines (aflatoxines) reconnues cancérigènes.

Les aflatoxines sont considérées comme les plus carcinogènes des toxines naturelles, par le centre international de recherche sur le cancer (IARC) [1].

Au Burkina Faso, des études antérieures ont montré l’existence de fortes teneurs en mycotoxines (aflatoxines, fumonisines) dans les céréales (maïs), les arachides et leurs produits dérivés[2, 3]. Le présent travail s’inscrit dans un programme de lutte contre les mycotoxines au sein de l’université de Ouagadougou (CRSBAN) [4].

Les objectifs spécifiques sont :

- l’isolement et la caractérisation d’une souche d’Aspergillus productrice d’aflatoxines, à

partir de l’arachide ;

- l’ étude des performances de production d’aflatoxines par la souche d’Aspergillus isolée ;

- l’inhibition de la croissance et de la production d’aflatoxines chez la souche isolée.

Pour les tests d’inhibition, des plantes utilisées par les paysans pour la conservation des récoltes ont été utilisées.
3. MATERIEL ET METHODES
3.1. Echantillonnage et identification des espèces végétales à propriétés antifongiques

L’échantillonnage des espèces végétales s’est déroulé, dans l’Ouest du Burkina Faso, à la suite d’une enquête ethnobotanique. Il a concerné les espèces végétales fongicides ou fongistatiques utilisées par les paysans pour la conservation des récoltes.


3.2. Isolement et caractérisation de la souche d’Aspergillus

3.2.1. Isolement

L’isolement de la souche est réalisée à partir d’un consortium de champignons poussés sur un échantillon de graines d’arachide. La sélection de la souche est faite par repiquage en point par épuisement sur le bouillon mazé gélosé. Pour la détermination systématique, la souche purifiée a été repiquée sur le milieu non sélectif de Czapeck Yeast Extract Agar (CYA) selon les méthodes utilisées par Hocking, 1982, Cotty, 1993 et Christensen, 1981 [5-7].



3.2.2. Caractérisation de la souche d’Aspergillus isolée

- Les caractères culturaux tels que le diamètre, la couleur des colonies et la variation de la couleur en fonction du temps, le changement de couleur du milieu et la texture de la surface ont étés évalués sur la souche isolée.

- L’étude des caractères microscopiques est réalisée à l’aide d’un microscope optique. Les éléments structuraux ont été dimensionnés sur une lame micrométrique porte objet. Les caractéristiques microscopiques telles que présence ou absence de métules, arrangement et forme des phialides, forme et taille de la vésicule, forme, taille et couleur des conidies, couleur et taille du conidiophore, ont été étudiées.
3.3. Production d’aflatoxines

La souche isolée est mise en culture sur le milieu de Czapeck et incubée à l’étuve entre (28-30°c) pendant 10 jours. Les conidies sont récoltées, nettoyées, et comptées à la cellule de Nageotte.

La production d’aflatoxines est réalisée par culture de la souche d’Aspergillus isolée dans le milieu de Reddy modifié. Les aflatoxines sont extraites à l’aide d’un solvant méthanol-eau (80:20 ; v/v) et dosées selon la méthode décrite par KIM et al., 2001 [8].

Le dosage est réalisé après dérivation à l’acide trifluoroacétique et séparation par HPLC en phase inversée (C18). L’identification et la quantification des aflatoxines se font respectivement sur base des temps de rétention et des aires des pics chromatographiques des échantillons par rapport aux standards dérivatisés injectés [9].


3.5. Inhibition de la croissance et de la production d’aflatoxines

Des extraits totaux de plantes (Hyptis spicigera, Hyptis suaveolens, Cassia nigricans) sont obtenus par décoction et lyophilisation.

L‘inhibition est conduite avec une gamme de concentrations croissantes de 4 mg, 8 mg et 12 mg des extraits dans le milieu de culture liquide synthétique de Reddy modifié.
4. RESULTATS ET DISCUSSION
4.1. Résultats de la culture cellulaire

L’étude des caractères culturaux et microscopiques a été faite par référence aux travaux de Christensen, 1981, Guiraud, 1998 et Hocking, 1982, [7, 10, 5].


4.1.1 Caractères culturaux

Les colonies poussées à 25°C sur milieu de Czapek gélosé, ont un diamètre de 70 – 72 mm après 6 jours d’incubation. Elles sont de couleur blanc-crème à jaunâtre devenant vert-olive avec l’âge. La bordure est jaune-crème veloutée. Le centre est floconneux. Les colonies ont un aspect concentrique rayonnant.

A 37°C, les colonies ont une croissance plus rapide et atteignent 88 - 90 mm de diamètre après 4 jours d’incubation. La couleur a une évolution identique mais plus rapide qu’à 25° C.


Colonie de la souche d’Aspergillus isolée 48 h après ensemencement

G x 400

conidies

Phialides

Paroi de la vésicule

Conidiophore


Tête conidienne unisériée de la souche d’Aspergillus isolée vue au microscope



Colonie de la

souche d’Aspergillus

isolée 192 h après ensemencement

Figure 1. Colonies et tête conidienne de la souche aflatoxinogène isolée
4.1.2. Caractères microscopiques
Tableau 1. Comparaison des caractères microscopiques de la souche d’Aspergillus avec les travaux d’autres auteurs.

Caractères microscopiques



Travaux de CHRISTENSEN, 1981

Travaux de HOCKING, 1982

Présent travail



Tête conidienne

Rayonnante, uniseriée et ou bisériée

Rayonnante et unisériée ou bisériée

Rayonnante unisériée et bisériée

Vésicule de la tête conidienne

Globuleuse à subglobuleuse, diamètre compris entre 30 et 130 µm

Sphéroïdale à subsphéroïdale, de diamètre 20 à 40 µm

Globuleuse à subglobuleuse, de diamètre 50 à 60 µm

Epaisseur de la paroi de la vésicule

1 à 5 µm

Pas de donnée

1 à 2 µm

Conidies

3,7 à 12 µm

Sphériques à subsphéroïdales, surface épineuse, diamètre de 3,5 à 4 µm

Sphériques à subsphéroïdales, surface épineuse, diamètre de 3,7 à 4 µm

A l’issue de l’étude des caractères culturaux et microscopiques et en comparaison avec des données précédemment publiées[5, 7], nous pouvons classer provisoirement la souche isolée dans l’espèce Aspergillus parasiticus.

En plus, les résultats sur la production d’aflatoxines montrent que la souche produit les quatre types d’aflatoxines B1, B2, G1 et G2. Cette caractéristique est retrouvée chez Aspergillus parasiticus à l’opposé de Aspergillus flavus qui ne produit que les aflatoxines B1 et B2 [9 ].
Tableau 2. Capacité d’inhibition de la croissance de la souche d’Aspergillus par des extraits bruts de plantes


Teneur en substance inhibitrice

4 mg /mL

8 mg/mL

12 mg/mL

Nom de la plante

Taux d’inhibition en %

Cassia nigricans

-19

11

22

Hyptis suaveolens


25

24

30

Hyptis spicigera


39

33

43

Tableau 3. Capacité d’inhibition de la production d’aflatoxines par des extraits bruts de plantes




Nom de la plante

Teneur en substance inhibitrice (mg/mL)

Inhibition (%) AFB1

Inhibition (%) AFG1

Hyptis suaveolens


8

18

-622

Hyptis spicigera


12

7

45

La production des aflatoxines AFB2 et AFG2 n’a pas été inhibée par les deux plantes. Nous n’avons pas observé d’inhibition de la production d’aflatoxine par la concentration de 4mg/mL en substance inhibitrice. La concentration de 8mg/mL n’a pas inhibé la production de l’aflatoxine G1 qui a plutôt été accrue d’un facteur de 622. L’explication de ce phénomène pourrait résider dans la régulation génétique de la biosynthèse des aflatoxines. En effet, les travaux de CHANG[11], 1995 ont montré que le gène aflR responsable de la biosynthèse des aflatoxines est autorégulé. Cette autorégulation se ferait par la production d’activateurs tels l’AFLR de la voie de biosynthèse des aflatoxines. L’effet de ces activateurs varie en fonction de la composition du milieu de culture et également des conditions de cultures.



5. CONCLUSION

L’enquête de terrain a montré que 18 % des paysans qui cultivent l’arachide utilisent les plantes pour sa conservation. Certaines de ces plantes renferment un pouvoir fongistatique et inhibiteur d’aflatoxines. C’est le cas de Hyptis spicigera, Hyptis suaveolens et Cassia nigricans dans la présente étude.

A travers ce travail, il a été démontré que les pratiques empiriques des paysans en matière de conservation post-récolte, ont un fondement scientifique.

La souche d’Aspergillus isolée, purifiée et caractérisée peut-être classée provisoirement dans l’espèce Aspergillus parasiticus.

La production d’aflatoxines a été réalisée sur un milieu synthétique et les différentes aflatoxines B1, B2, G1, G2 ont été identifiées et quantifiées.

Ces résultats devraient être complétés par :

-une étude génétique de la souche d’Aspergillus isolée pour permettre sa classification définitive ;

- l’extraction et l’identification formelle des principes actifs inhibiteurs des plantes étudiées ;

- l’extension de l’étude d’inhibition à d’autres types de champignons toxinogènes (Fusarium) ;

- la détermination des concentrations minimales inhibitrices (CMI) des principes actifs inhibiteurs ;

- l’élucidation de leurs mécanismes d’action ;

- la mise au point de biopesticides efficaces abordables et applicables par les paysans.



Références bibliographiques

[1]. I.A.R.C. Environmental carcinogens selected methods of analysis. 5. Some Mycotoxins. IARC Scient. Pub, 44, 1982.

[2]. Nikiéma, P. A. Etude des aflatoxines au Burkina Faso: Détermination quantitative et qualitative des aflatoxines de l’arachide par des tests biochimiques et immunologiques. Thèse de Doctorat de spécialité Sciences Biologiques Appliquées. Université de Ouagadougou. 1993.

[3].

Sanoud, D. Etude de la prévalence des mycotoxines dans les produits agricoles du Burkina Faso : Cas de la contamination du maïs (Zea mays L.) par les aflatoxines et les fumonisines dans l’Ouest du Burkina. Mémoire de DEA, université de Ouagadougou. 2000 . .



[4]. Nikiéma, P. A. Dietary Patterns and exposure to aflatoxin in rural area of Burkina Faso: Design of a cross- sectional study. 1999.

[5]. Hocking, A. D. Food Technology in Australia. 34 ( 1982) 1-3.

[6]. Cotty , P. J., Mycopathologia. 125 (1994) 157-162.

[7]. Christensen, M. Mycologia. 73 (1981)1056-1084

[8]. Kime, K.; Shon, D. H.; Yoo, J. Y.; Ryu, D.; Lee, C. et Kim, Y. B. Food Additives and Contaminants. 18 (2001) 151-156.

[9]. Kozakiewicz, Z. In Highley, E., et Johnson, G.I. (Eds). Mycotoxins contamination of grains. ACIAR Technical Reports 37 (1996) 18-26.

[10]. Guiraud, J. P., 1998. Microbiologie alimentaire. Dunod, Paris, 1998 , p. 328-330.

[11]. Chang, P. K., Ehrlich, K.C., Yu, J., Bhatnagar, D. et Cleveland, T.E. Appl. Envir. Microbiol. 61 (1995) 2372-2377.







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