Ana səhifə

Особенности ядерных и митохондриальных геномов у аллоплазматических эуплоидных и анеуплоидных линий (Hordeum marinum subsp gussoneanum)-Triticum aestivum


Yüklə 307 Kb.
tarix15.06.2016
ölçüsü307 Kb.

На правах рукописи

ТРУБАЧЕЕВА

НАТАЛИЯ ВИКТОРОВНА



ОСОБЕННОСТИ ЯДЕРНЫХ И МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ГЕНОМОВ У

АЛЛОПЛАЗМАТИЧЕСКИХ ЭУПЛОИДНЫХ И АНЕУПЛОИДНЫХ ЛИНИЙ (Hordeum marinum subsp. gussoneanum)-Triticum aestivum

Генетика - 03.00.15.

АВТОРЕФЕРАТ
Диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Новосибирск 2007

Работа выполнена в лаборатории хромосомной инженерии злаков Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск, Россия

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Першина Лидия Александровна

Институт цитологии и генетики СО РАН

г. Новосибирск


Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Дорогина Ольга Викторовна

Центральный ботанический сад СО РАН

г. Новосибирск


кандидат биологических наук

Будашкина Екатерина Борисовна

Институт цитологии и генетики СО РАН

г. Новосибирск


Ведущее учреждение: Томский государственный университет,

г. Томск


Защита диссертации состоится “___”____________2007 г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск-90, проспект академика Лаврентьева, 10.

т/ф: (383)333-12-78, e.mail: dissov@bionet.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан “___”____________2007г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор биологических наук А.Д. Груздев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Отдаленная гибридизация является фактором, играющим важную роль в видообразовании покрытосеменных растений (Вавилов, 1960; Soltis et al., 1999; 2000; Kellog, 2003). Экспериментальное получение отдаленных гибридов позволяет моделировать процессы видообразования (Riesenberg et al., 1997; 2003; Feldman et al., 1997), оценивать степень филогенетического родства между отдельными видами (Burow et al., 2001), выявлять особенности ядерно-цитоплазматических взаимодействий (Maan, 1991; 1992a; Asakura et al., 2000), проводить хромосомную локализацию и картирование генов (Hsam et al., 2000).

Кроме того, отдаленная гибридизация лежит в основе комплекса методов хромосомной инженерии, направленных на увеличение генетического разнообразия культурных растений, включая мягкую пшеницу T.aestivum L. (Sears, 1972; Цицин, 1979; Friebe et al., 1996). С целью интрогрессии в геном мягкой пшеницы новых генов, контролирующих хозяйственно-ценные признаки, ее скрещивают как с видами рода Triticum L. (Friebe et al., 1996; Лайкова и др., 2004a; b), так и с видами других родов трибы Triticeae (Иванов, 2006), включая род Hordeum L. (Fedak, 1992; Islam, 2002). Так, на основе ячменно-пшеничных амфиплоидов, полученных с участием дикорастущего ячменя H.chilense Roem. et Schultz., создана новая зерновая культура Tritordeum Ascherson et Graebner (Alvarez et al., 1992). Скрещивания мягкой пшеницы с культурным ячменем H.vulgare L. привели к получению пшенично-ячменных дополненных (Islam, Shepherd, 1990), замещенных (Islam et al., 1992b), аллоплазматических рекомбинантных линий (Першина и др., 1995; 1999), используемых в генетических исследованиях. Среди других видов Hordeum интерес представляют подвиды дикорастущего ячменя H.marinum Hudson, характеризующиеся устойчивостью к абиотическим стрессам (Кобылянский, 1967; Bothmer et al., 1991) и способностью давать при скрещивании с пшеницей гибриды, восстанавливающие фертильность при колхицинировании и беккроссировании (Pershina et al., 1988; 1998; Islam, 2002; Пендинен и др., 2003).

Установлено, что отдаленные скрещивания приводят к реорганизации ядерных геномов (Liu et al., 1998; Ozkan et al., 2001; Shaked et al., 2001) и нарушениям ядерно-цитоплазматических взаимодействий (Asakura et al., 2000), оказывая влияние на жизнеспособность и фертильность растений. Следует подчеркнуть, что широко проводимые исследования процессов реорганизации ядерных геномов при формообразовании на основе отдаленной гибридизации растений, в том числе злаков, не затрагивают проблем изменчивости цитоплазматических геномов и ядерно-цитоплазматических взаимодействий (Feldman et al., 1997; Ozkan et al., 2001; Shaked et al., 2001).

В связи с этим представляется актуальным проведение параллельного изучения особенностей ядерных и цитоплазматических геномов у растений гибридного происхождения. В этом отношении удобными моделями для исследования и процессов ядерно-цитоплазматических взаимодействий, и наследования цитоплазматических геномов являются аллоплазматические линии, представляющие собой сочетание чужеродных по отношению друг к другу ядерных и цитоплазматических геномов различных видов (Палилова, 1986, Tsunewaki et al., 1996).



Цель и задачи исследования Цель работы – изучение с использованием комплекса молекулярно-генетических методов особенностей ядерных и митохондриальных геномов аллоплазматических эуплоидных и анеуплоидных линий, полученных на основе ячменно-пшеничных гибридов Hordeum marinum subsp. gussoneanum (Parl.) Thell.(2n = 28) (=H.geniculatum All.) х Triticum aestivum L. (2n = 42).

Задачи работы

  1. Охарактеризовать с применением RAPD-анализа ядерные геномы аллоплазматических эуплоидных и анеуплоидных линий (H.marinum subsp. gussoneanum)-T.aestivum разного происхождения.

  2. Провести геномную in situ гибридизацию (GISH) для выявления хромосом дикорастущего ячменя и их фрагментов в геноме аллоплазматических эуплоидных и анеуплоидных линий (H. marinum subsp. gussoneanum)-T. aestivum.

  3. Определить хромосомный состав аллоплазматических замещенных

(2n = 40w + 2b) и анеуплоидных (2n = 40w + 2tw + 2tb) линий с использованием микросателлитных (SSR) маркеров мягкой пшеницы.

  1. Провести сравнительный анализ ряда последовательностей митохондриальной ДНК (мтДНК) на основе ПЦР- и RFLP-анализа у аллоплазматических эуплоидных и анеуплоидных линий (H.marinum subsp. gussoneanum)-T.aestivum с разным проявлением фертильности.

Научная новизна работы

Впервые с применением комплекса молекулярно-генетических методов исследованы особенности ядерных и митохондриальных геномов аллоплазматических эуплоидных и анеуплоидных линий мягкой пшеницы, полученных на основе ячменно-пшеничных гибридов H.marinum subsp. gussoneanum (2n = 28) х T.aestivum (2n = 42). Показано, что процесс формообразования при самоопылении растений беккроссных поколений BC1-BC4, полученных при возвратных скрещиваниях гибридов с мягкой пшеницей, приводит к стабилизации кариотипов, близких к кариотипу мягкой пшеницы, но с тенденцией включения хромосом дикорастущего ячменя. Самофертильность и цитогенетическая стабильность аллоплазматических линий мягкой пшеницы, у которых одна или три пары хромосом замещены на гомеологичные пары хромосом H.marinum subsp. gussoneanum, указывает на компенсационную способность хромосом ячменя в отношении гомеологичных хромосом мягкой пшеницы. По данным SSR-анализа образование аллоплазматических замещенных линий происходит преимущественно с замещением хромосом мягкой пшеницы 7D на гомеологичные ячменя. Образование самофертильных аллоплазматических дополненных линий мягкой пшеницы связано с участием телоцентрических хромосом дикорастущего ячменя. Обнаружена взаимосвязь между присутствием последовательностей мтДНК определенного родительского типа, наличием хромосом ячменя в геноме аллоплазматических линий и проявлением фертильности растений.



Положения, выносимые на защиту.

  1. Формирование самофертильных аллоплазматических эуплоидных и анеуплоидных линий, сформированные на основе ячменно-пшеничных гибридов H.marinum subsp. gussoneanum (2n = 28) x T. aestivum (2n = 42) сопровождается встраиванием хромосом дикорастущего ячменя в геном мягкой пшеницы.

  2. Основной вариант образования аллоплазматических замещенных линий у самоопыленных потомков беккроссных поколений ячменно-пшеничных гибридов H.marinum subsp. gussoneanum (2n = 28) x T. aestivum (2n = 42) связан с замещением хромосом мягкой пшеницы 7D на гомеологичные хромосомы дикорастущего ячменя.

  3. У аллоплазматических линий мягкой пшеницы, имеющих цитоплазму дикорастущего ячменя H.marinum subsp. gussoneanum, присутствие определенного типа последовательностей мтДНК ассоциировано с проявлением фертильности растений и наличием хромосом ячменя в ядерном геноме.

Научно-практическая значимость работы

В результате проведенного исследования получены новые данные, подтверждающие совместимость ядерного генома мягкой пшеницы и цитоплазмы ячменя H.marinum subsp. gussoneanum и демонстрирующие возможность получения самофертильных замещенных и дополненных линий мягкой пшеницы с цитоплазмой этого дикорастущего вида. Высокий уровень полиморфизма между RAPD-спектрами дикорастущего ячменя и мягкой пшеницы позволяет эффективно использовать RAPD-анализ для изучения геномов потомков ячменно-пшеничных гибридов. Последовательности, выделенные из мтДНК мягкой пшеницы, могут эффективно использоваться для дифференциации митохондриальных геномов пшеницы и дикорастущего ячменя у гибридных растений.



Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов, обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Материал диссертации изложен на 156 страницах печатного текста, включая 14 таблиц и 12 рисунков. Список цитируемой литературы содержит 408 работ.

Публикации. По результатам исследования опубликовано 15 работ, в том числе 5 статей в рецензируемых изданиях.

Апробация работы Результаты работы были представлены на 11ой конференции EWAC, Новосибирск, 2000; Международной конференции “Genetic Collection, Isogenic and Alloplasmic Lines, Новосибирск, 2001; Международной конференции по отдаленной гибридизации, Москва, 15-17 декабря 2003; II конференции МОГиС, Москва, 2003; III съезде ВОГиС, Москва, 2004; V Международном совещании и Школы молодых ученых по кариологии, кариосистематике и молекулярной систематике растений, Санкт - Петербург, 2005; Отчетной конференции «Динамика генофондов растений, животных и человека», Москва, 2005; Всероссийской научной конференции ”Структура и экспрессия митохондриального генома растений”, Иркутск, 2006 и обсуждались на отчетных сессиях ИЦиГ СО РАН (2001, 2004).

Благодарность Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований проекты МАС (№ 02-04-06745, 02-04-48416), проект РФФИ № 05-04-48600, программа Президиума РАН «Геном растений», комплексного интеграционного проекта СО РАН “Динамика генофондов растений, животных и человека”, грант Фонда Министерства Сельского и Лесного Хозяйства Германии. Автор выражает благодарность д.б.н. Салиной Е.А. за предоставленную возможность проведения молекулярно-генетических экспериментов и консультации при обсуждении результатов, сотруднице Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгарда д.б.н. Е.Д. Бадаевой за проведение цитогененетического анализа ряда линий, д-р М. Родер за возможность выполнения SSR-анализа в лаборатории картирования генов и геномов растений (IPK, Гатерслебен, Германия).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ


МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Изучены аллоплазматические эуплоидные и анеуплоидные линии, c разным проявлением фертильности, сформированные на основе отдельных растений самоопыленных потомков беккроссных поколений BC1–BC4 ячменно-пшеничных гибридов H.marinum subsp. gussoneanum (Parl.) Thell. (2n=28) (=H.geniculatum All.) (2n=28) х T.aestivum (Пиротрикс 28) (2n=42), о получении которых сообщалось в работах (Pershina et al., 1988; 1998). В работу также были включены 54-хромосомная линия, выделенная среди самоопыленных потомков F3 цитогенетически нестабильного ячменно-пшеничного амфиплоида, и телоцентрически дополненная линия, полученная от растения – самоопыленного потомка BC1 амфиплоида. В таблице 1 представлены данные о происхождении изученных линий и числе хромосом, характерных для линии. Кроме того, изучены потомки растений, выделенных от одного из 42-хромосомных растений BC4F3-поколения, обозначенного как растение 218. В процессе работы на основе растения 218(1) создана линия Л-36, а растения 218(3) – линия Л-35. По признакам фертильности линии и потомки растений группы 218 относились к следующим группам: стабильно самофертильные – Л-31, Л-36, Л-38, 218(1), 218(2); с пониженной фертильностью – Л-28, Л-29, Л-26, Л-27, Л-35, Л-49, Л-503, 218(3), 218(7), 218(9), 219(12), 218(14); практически полностью стерильные в последующих самоопыленных поколениях – Л-32, 218(11). В качестве контроля брали родительские генотипы – ячмень H.marinum subsp. gussoneanum (H.mar) и сорта мягкой пшеницы Пиротрикс 28 и Новосибирская 67.

ДНК растений выделяли по методике с применением протеиназы К (Дрейпер и др., 1991). Использованы следующие методы молекулярно-цитогенетического анализа: геномная in situ гибридизация (GISH) – гибридизация препаратов митотических хромосом с флуоресцентно-меченой тотальной ДНК; молекулярно-генетического анализа: RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) – метод, основанный на получении специфического набора фрагментов ДНК различной длины (RAPD-спектра) при использовании ПЦР c одиночным праймером c произвольной последовательностью нуклеотидов (Williams et al., 1990); SSR-анализ (Simple Sequence Repeat) – анализ микросателлитных локусов, картированных на хромосомах мягкой пшеницы (Röder et al., 1998); RFLP-анализ (Restriction Fragment Length Polymorphism) с использованием клонированных последовательностей митохондриальной ДНК (Tsukamoto et al, 1990); ПЦР-анализ со специфическими праймерами к участку, фланкирующему 5’-конец 18S/5S рекомбинационного повтора митохондриальной ДНК злаков (Coulthart et al., 1993). В качестве зонда для геномной in situ гибридизации (Leitch et al. 1994) использовалась геномная ДНК ячменя (H.mar), меченая биотином.
Таблица 1. Происхождение использованных в работе образцов аллоплазматических линий (H. marinum subsp. gussoneanum)-T. aestivum.


Номера линий

Происхождение линий

Число хромосом у

изученных образцов



Л-28

Л-29


Л-49

Л-31


Л-26

Л-27


Л-32

Л-35


Л-36

Л-38


Л-503

BC1F10:[(mar xП)xП]F10

BC1F10:[(mar xП)xП]F10

ВС2F9, 11:[(mar xП)xП2]F9,11

BC2F8:[(mar xП)хПхН]F8

BC3F8:[(mar xП)xПхН2]F8

BC3F8:[(mar xП)xПхН2]F8

BC3F8:[(mar xП)хПхН2]F8

BC4F7:[(mar x П)хПхН3]F7

BC4F7:[(mar xП)хПхН3]F7

ВС1F8, 9:[mar xП)ам х П]F8,9

[(mar xП)Ам]F5


2n = 42

2n = 42


2n = 42

2n = 42


2n = 40 + 4t

2n = 40 + 4t

2n = 40 + 2t

2n = 42


2n = 42

2n = 42 + 2t

2n = 54


Номера

растений


Происхождение растений

Число хромосом у

изученных образцов




218(1)

218(2)


218(3)

218(7)


218(9)

218(11)


218(12)

218(14)


BC4F5: [(mar xП)xПxН3]F5

BC4F5: [(mar xП)xПxН3]F5

BC4F5: [(mar xП)xПxН3]F5

BC4F5: [(mar xП)xПxН3]F5

BC4F5: [(mar xП)xПxН3]F5

BC4F5: [(mar xП)xПxН3]F5

BC4F5: [(mar xП)xПxН3]F5

BC4F5: [(mar xП)xПxН3]F5




2n = 42

2n = 42


2n = 42

2n = 42


2n = 42

2n = 42


2n = 42

2n = 42


Обозначения: mar - дикорастущий ячмень H.marinum subsp. gussoneanum,

П – сорт мягкой пшеницы Пиротрикс 28, Н – сорт мягкой пшеницы

Новосибирская 67, Ам – амфиплоид.

Для RAPD-анализа применены 115 случайных праймеров длиной 10-11 пн с GC-составом от 36% до 72%. С целью подтверждения данных RAPD-анализа о ячменном происхождении отдельных RAPD-фрагментов у аллоплазматических линий были проведены эксперименты по кросс-гибридизации (Трубачеева и др., 2003). Для этого RAPD-продукт ячменя (H.mar) с определенным праймером радиоактивно метился и использовался в качестве зонда для гибридизации с RAPD-спектром аллоплазматических линий, полученным при помощи того же праймера. SSR-анализ с применением 89 SSR-маркеров, картированных на хромосомах мягкой пшеницы, проводили по методике, описанной в работе (Plaschke et al., 1995). RFLP-анализ последовательностей мтДНК проводился с зондами, гомологичными участкам трех генов митохондриального генома мягкой пшеницы. Для ПЦР-анализа 18S/5S рекомбинационного повтора злаков использовалась пара специфичных праймеров. Условия RFLP- и ПЦР анализа мтДНК приведены в работе (Трубачеева и др., 2005).


РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

RAPD-анализ аллоплазматических эуплоидных и анеуплоидных линий (H.marinum subsp. gussoneanum)-T.aestivum


RAPD-анализ был проведен с целью предварительного скрининга образцов аллоплазматических линий для выявления наличия в их геномах генетического материала ячменя. Для изучения были включены аллоплазматические линии, соответствующие самоопыленным потомкам разных беккроссных поколений (Л-29, Л-26, Л-27, Л-36, Л-38) и линия Л-503, являющаяся самоопыленным потомком ячменно-пшеничного амфиплоида.

На начальном этапе проведен сравнительный анализ RAPD-спектров мягкой пшеницы и дикорастущего ячменя (H.mar). Оказалось, что при использовании практически всех праймеров RAPD-спектры дикорастущего ячменя (H.mar) отличались от RAPD-спектров сортов мягкой пшеницы. Таким образом, высокий уровень полиморфизма между ПЦР-спектрами дикорастущего ячменя и мягкой пшеницы может позволить использовать RAPD-метод для выявления фрагментов генома ячменя во вновь сформированном геноме аллоплазматических линий мягкой пшеницы, полученных на основе ячменно-пшеничных гибридов.

Обнаружено, что RAPD-спектры линий Л-29, Л-26, Л-27, Л-36 и Л-38, полученные с применением большинства праймеров, практически идентичны RAPD-спектрам родительских сортов пшеницы. Вместе с тем в RAPD-спектрах изученных аллоплазматических линий в ряде случаев были обнаружены изменения по сравнению со спектрами родительских видов, такие как исчезновение фрагментов, специфичных для мягкой пшеницы, и появление новых, не свойственных ни мягкой пшенице, ни дикорастущему ячменю. Этот результат свидетельствует о том, что процесс формирования аллоплазматических линий включает в себя реорганизацию геномов родительских видов. Интенсивные преобразования ядерных геномов на ранних этапах формообразования при отдаленных скрещиваниях и полиплоидизации описаны во многих работах (Feldman et al., 1997; Liu et al., 1998; Ozkan et al., 2001; Shaked et al., 2001).

Другие отличия в RAPD-спектрах аллоплазматических линий от родительских генотипов пшеницы связаны с присутствием фрагментов амплификации ячменя (H.mar). Спектры амплификации 19 праймеров, то есть 17% от числа использованных, содержали фрагменты генома ячменя у линии Л-29; 7 (6%) - у линии Л-26; 8 (7%) - у линии Л-27; одного (0.9%) – у линии Л-36. Пять праймеров амплифицировали фрагменты генома ячменя одинаковой длины у линий Л-29, Л-26 и Л-27. Поскольку RAPD-фрагменты одинаковой длины могут амплифицироваться из негомологичных последовательностей, то для подтверждения ячменного происхождения фрагментов в спектрах гибридных линий была проведена серия экспериментов по кросс-гибридизации. Проведенные эксперименты показали, что во всех случаях, когда при электрофорезе в агарозном геле в спектре аллоплазматической линии присутствовал фрагмент, соответствующий по длине фрагменту ячменя (H.mar), этот же фрагмент наблюдался в гибридизационном профиле как ячменя (H.mar), так и аллоплазматической линии (рис. 1).




Рис. 1. RAPD-спектр, полученный с использованием праймера R506 и результат кросс-гибридизации с этим RAPD-спектром H.marinum subsp. gussoneanum. Стрелками обозначены фрагменты ячменя, выявляемые у аллоплазматических линий, цифрами – длина этих фрагментов в пн.
1 – H.marinum subsp. gussoneanum

2 – T.aestivum Пиротрикс 28

3 – линия Л-26

4 – линия Л-27

5 – линия Л-36

6 – линия Л-29





1 2 3 4 5 6



1500

1500



Таким образом, проведенное исследование аллоплазматических линий с помощью RAPD-анализа показало, что их геномы преимущественно пшеничного типа, но имеют ряд особенностей, проявляющихся в виде отличий в RAPD-спектрах от родительских сортов пшеницы. Кроме того, в геномах этих линий обнаружено присутствие фрагментов амплификации генома ячменя. Наибольшее количество фрагментов ячменя наблюдали у линии Л-29, выделенной среди самоопыленных потомков ВС1-поколения. У линий Л-26 и Л-27, принадлежащих к ВС3F8-поколению, и особенно у линии Л-36 (ВС4F7), количество обнаруженных фрагментов генома ячменя значительно меньше. Телоцентрически дополненная линия Л-38 также содержит фрагменты генома дикорастущего ячменя (H.mar).

Для выявления присутствия фрагментов генома ячменя в геноме линии Л-503 были использованы 25 праймеров, для которых была показана эффективность в выявлении генетического материала дикорастущего ячменя в геномах аллоплазматических линий, сформированных на основе беккроссных потомков ячменных-пшеничных гибридов. В данной части работы было обнаружено, что 7 из 25 праймеров амплифицируют фрагменты генома ячменя у линии Л-503. Таким образом, применение RARD-анализа подтвердило присутствие фрагментов генома ячменя в геноме этой линии. Однако, тот факт, что не все взятые в анализ праймеры обнаруживали наличие генетического материала ячменя у линии Л-503, указывает на то, что процессы формирования ядерных геномов в результате беккроссирования ячменно-пшеничных гибридов и самоопыления амфиплоида проходили различными путями.


Геномная in situ гибридизация аллоплазматических эуплоидных и анеуплоидных линий (H.marinum subsp. gussoneanum)-T.aestivum


Проведенный RAPD-анализ позволил установить наличие генетического материала ячменя (H.mar) в геномах аллоплазматических линий мягкой пшеницы, однако этот метод не дает возможности определить характер интрогрессии генома ячменя. Для решения этой задачи был применен метод геномной гибридизации in situ с применением тотальной ДНК ячменя в качестве зонда. В качестве объектов исследования были использованы аллоплазматические 42-хромосомные линии Л-28, Л-29, Л-49, Л-31, Л-35, Л-36 и растения, выращенные из зерновок, завязавшихся у эуплоидных растений 218(1), 218(2), 218(3), 218(11), 218(12), а также анеуплоидные линии Л-26, Л-27, Л-38.

Установлено, что 42-хромосомные линии Л-28 и Л-29, выделенные от разных растений BC1F9-поколения ячменно-пшеничных гибридов и различающиеся друг от друга по проявлению фенотипических признаков, содержат в кариотипе неодинаковое число хромосом дикорастущего ячменя. Так, у аллоплазматической линии Л-28 обнаружено замещение трех пар хромосом пшеницы на три пары хромосом дикорастущего ячменя, геномная формула – 2n = 36w + 6b (w – wheat, b – barley) (рис. 2). При параллельном изучении этой линии с помощью С-окрашивания Е.Д. Бадаевой тип замещений был идентифицирован как 1Hmar(1B), 5Hmar(5D), 7Нmar(7D) (Трубачеева, Бадаева и др., 2007).

У другой аллоплазматической линии Л-29, соответствующей ВС1F10-поколению, произошло замещение одной пары хромосом пшеницы на одну пару хромосом ячменя (2n = 40w + 2b) (табл. 3).


Рис. 2. Результаты GISH-анализа аллоплазматической пшенично-ячменной замещенной линии Л-28 (ВС1F10-поколение) 2n = 42 = 36w + 6b (w – wheat, b – barley).

Белым цветом окрашены хромосомы ячменя H.marinum subsp. gussoneanum.

ячменя H.marinum subsp. gussoneanum.

лым цветом окрашены хромосомы ячменя H.marinum subsp. gussoneanum.




Рис. 3. Результаты GISH-анализа растения 218(3) (ВС4F4-поколение) 2n = 42 = 40w + 2b.

Белым цветом окрашены хромосомы ячменя H.marinum subsp. gussoneanum.


Замещение одной пары хромосом мягкой пшеницы на пару хромосом дикорастущего ячменя выявлено и у генотипов, выделенных от растений самоопыленных потомств более поздних беккроссов – BC2 и BC4. При этом среди шести изученных растений линии Л-49, принадлежащих к BC2F9-поколению, пять, выращенные из нормально выполненных зерновок, имели замещение по одной паре хромосом (2n = 40w + 2b), а у одного растения, выращенного из щуплой зерновки, обнаружено отсутствие только одной хромосомы мягкой пшеницы, замещенной хромосомой дикорастущего ячменя (2n = 41w + 1b). Дальнейший отбор растений, выращенных из выполненных зерновок привел к цитогенетической стабильности линии Л-49, образцы которой, соответствующие BC2F11-поколению, были включены в дальнейшую работу.

У линии Л-31, принадлежащей ВС2F8-поколению, с использованием GISH-анализа выявлены только хромосомы мягкой пшеницы (2n = 42w). Такой же набор хромосом выявлен и у потомков 42-хромосомных растений 218(1) и 218(2), относящихся к BC4F5-поколению. На основе растения 218(1) была создана линия Л-36, у изученных образцов которой в BC4F7-поколении сохранился кариотип, соответствующий (2n = 42w).

Что касается потомков растений 218(3), 218(11), 218(12) из BC4F5-поколения, то по данным GISH-анализа они имели геномную формулу (2n = 40w + 2b) (рис. 3). Растение 218(3) послужило источником для создания линии Л-35, при изучении которой в BC4F7-поколении также обнаружено замещение одной пары хромосом пшеницы на одну пару хромосом ячменя (2n = 40w + 2b).




Таблица 3. Обобщенные результаты геномной гибридизации in situ

Номера линий

Принад-лежность

линий


к поколениям

Число

хромосом


Геномная

формула


по результатам GISH

Л-28

Л-29


BC1F10

BC1F10



2n = 42

2n = 42


2n = 36w + 6b

2n = 40w + 2b



Л-49


ВС2F9


2n = 42

2n = 42


2n = 41w + 1b

2n = 40w + 2b



Л-26

Л-27


BC3F8

BC3F8



2n = 40 + 4t

2n = 40 + 4t



2n = 40w + 2tw + 2tb

2n = 40w + 2tw + 2tb



Л-35

Л-36


BC4F7

BC4F7



2n = 42

2n = 42


2n = 40w + 2b

2n = 42w


Л-38


ВС1F8

2n = 42 + t

2n = 42 + 2t



2n = 42w + 1tb

2n = 42w + 2tb



Номера растений

Принад-лежность

растений


к поколениям

Число

хромосом




Геномная

формула


по результатам GISH

218(1)

218(2)


218(3)

218(11)


218(12)

BC4F5

BC4F5

BC4F5

BC4F5

BC4F5


2n = 42

2n = 42


2n = 42

2n = 42


2n = 42

2n = 42w

2n = 42w


2n = 40w + 2b

2n = 40w + 2b

2n = 40w + 2b


GISH-анализ выявил, что у образцов аллоплазматических анеуплоидных линий Л-26 и Л-27 две из четырех телоцентрических хромосом принадлежат ячменю (H.mar), что соответствует геномной формуле (2n = 40w + 2tw + 2tb).

Среди образцов изученной телоцентрически дополненной линии Л-38, выделенной от растения (2n = 42 + 2t) в BC1F7-поколении ячменно-пшеничного амфиплоида, опыленного мягкой пшеницей, выявлены как растения, у которых в кариотипе содержится пара дополненных телоцентрических хромосом дикорастущего ячменя (2n = 42 + 2tb), так и растения, у которых кариотип несет только одну дополненную телоцентрическую хромосому H.marinum subsp. gussoneanum (2n=42+1tb).


SSR–анализ аллоплазматических замещенных (2n = 40w + 2b) и анеуплоидных (2n = 40w + 2tw + 2tb) линий с применением микросателлитных маркеров пшеницы


С целью идентификации хромосомного состава аллоплазматических линий был использован SSR-анализ, основанный на применении микросателлитных маркеров, локализованных на определенных хромосомах мягкой пшеницы. По наличию или отсутствию фрагментов амплификации соответствующей длины, характерных для определенных маркеров, можно сделать вывод о присутствии в геноме изучаемых аллоплазматических линий тех хромосом мягкой пшеницы (или ее фрагментов), на которых картированы данные маркеры. Задача данного раздела работы – с помощью анализа микросателлитов выявить, какие хромосомы мягкой пшеницы замещены хромосомами дикорастущего ячменя.

В эту часть работы были включены линии Л-29, Л-49, Л-26, Л-27, Л-38 и потомство растений группы 218, которые были изучены с помощью геномной гибридизации in situ (табл. 3), а также линия Л-32 и потомство растений 218(7), 218(9), 218(14), которые не были изучены с применением GISH-анализа.

Для анализа были использованы 89 микросателлитных маркеров пшеницы (Xgwm). Количество маркеров на хромосому варьировало от 3 до 8, при этом использовались маркеры, локализованные как на коротком, так и на длинном плечах каждой хромосомы мягкой пшеницы. Изучение характера амплификации SSR-маркеров в геномах мягкой пшеницы и ячменя (H.mar) позволило выявить достаточно высокий уровень полиморфизма микросателлитных локусов как между сортами пшеницы Пиротрикс 28 и Новосибирская 67, так и между этими сортами пшеницы и дикорастущим ячменем H.marinum subsp. gussoneanum. Данное обстоятельство позволяет использовать SSR-маркеры мягкой пшеницы для анализа геномов у аллоплазматических линий – потомков ячменно-пшеничных гибридов.

Изучение аллоплазматических эуплоидных линий Л-29 и Л-49, в создании которых в качестве отцовского родителя использован только сорт мягкой пшеницы Пиротрикс 28, привело к выявлению в их геномах присутствия фрагментов амплификации, характерных для этого сорта пшеницы. Анализ распределения микросателлитных маркеров в геномах аллоплазматических анеплоидных линий Л-26 и Л-27 показал, что практически все хромосомы содержат одновременно маркеры обоих сортов мягкой пшеницы – Пиротрикс 28 и Новосибирская 67, использованных при создании этих линий. В геномах растений 218(3), 218(7), 218(9), 218(11), 218(12) и 218(14) большинство SSR-маркеров амплифицировали фрагменты, специфичные для сорта Новосибирская 67, используемого в трех из четырех возвратных скрещиваний с ячменно-пшеничными гибридами, и только хромосомы 5В и 7В содержали маркеры сорта мягкой пшеницы Пиротрикс 28. Таким образом, у аллоплазматических линий формируется ядерный геном, рекомбинантный по различным сортам пшеницы, введенным в беккроссирование.

В результате SSR-анализа в геномах аллоплазматических эуплоидных (2n=42) линий Л-29, Л-49, потомков растений 218(3), 218(7), 218(9), 218(11), 218(12), 218(14) и анеуплоидной линии Л-32 была обнаружена амплификация SSR-маркеров пшеницы (Xgwm) всех хромосом, за исключением маркеров, локализованных на 7D хромосоме. На основании этого можно сделать вывод о присутствии в кариотипах данных линий всех хромосом пшеницы, кроме хромосомы 7D. Отсутствующая пара хромосом 7D, по всей видимости, в кариотипе эуплоидов замещена на гомеологичную пару хромосом седьмой группы ячменя H.marinum subsp. gussoneanum (7Нmar). У анеуплоидной линии Л-32 с числом хромосом 2n = 40 + 2t отсутствующая пара хромосом 7D, по всей видимости, замещена парой телоцентриков, образовавшихся от хромосомы дикорастущего ячменя 7Нmar.

У аллоплазматических анеуплоидных линий Л-26 и Л-27 (2n = 42 + 4t) не выявлено продуктов амплификации маркеров короткого плеча хромосомы 7D, но наблюдалась амплификация маркеров длинного плеча хромосомы 7D. Это указывает на пшеничное происхождение некоторых из четырех телоцентрических хромосом у этих линий. Ранее проведенное исследование этих линий с помощью GISH-анализа свидетельствует о присутствии в их геномах двух телоцентрических хромосом пшеницы и двух телоцентрических хромосом ячменя (H.mar). Следовательно, пара телоцентрических хромосом пшеницы у линий Л-26 и Л-27 соответствует длинному плечу хромосомы 7D.

Принадлежность выявленных у линий Л-29, Л-26 и Л-27 хромосом ячменя или их сегментов седьмой гомеологичной группе ячменя была подтверждена методом С-окрашивания, проведенным Е.Д. Бадаевой (Трубачеева, Бадаева и др., 2007).

На основании полученных данных о геномном составе самофертильных аллоплазматических линий мягкой пшеницы, несущих цитоплазму дикорастущего ячменя H.marinum subsp. gussoneanum, можно заключить, что ядерный геном мягкой пшеницы и цитоплазма этого вида ячменя совместимы, а хромосомы ячменя способны компенсировать отсутствующие гомеологичные хромосомы пшеницы.


Изучение митохондриальных геномов аллоплазматических (H.marinum subsp. gussoneanum)-T.aestivum

RFLP-анализ локусов митохондриальной ДНК


Для определения типа родительских митохондриальных последовательностей у аллоплазматических линий был использован RFLP-анализ, в качестве зондов для которого выступали клонированные последовательности участков трех локусов мтДНК пшеницы nad3-orf156, atpA-atp9, atp6-rps13 (Wang et al., 2000; Tsukamoto et al., 2000). Соответствие клонированных вставок исходным последовательностям митохондриального генома было проверено секвенированием. Саузерн-блот гибридизация была проведена путем обработки тотальной ДНК тремя эндонуклеазами рестрикции с последующей гибридизацией каждого отдельного рестрикционного спектра с тремя митохондриальными зондами. Сравнение спектров блот-гибридизации выявило высокий уровень полиморфизма между дикорастущим ячменем и мягкой пшеницей, что позволяет считать данный метод подходящим для определения типов митохондриальных геномов у беккроссных потомков ячменно-пшеничных гибридов.

По результатам проведенного RFLP-анализа, изученные аллоплазматические линии можно разделить на две группы. Одну из них образуют линии Л-29, Л-26 и Л-27. Во всех проанализированных комбинациях эндонуклеаза рестрикции/зонд в гибридизационных спектрах этих линий присутствовали фрагменты митохондриального генома ячменя (H.mar), использованного в качестве материнского генотипа при создании ячменно-пшеничных гибридов F1. Вместе с тем у этих трех линий при использовании зонда nad3-orf156 во всех случаях были выявлены фрагменты блот-гибридизации обоих родительских видов – и дикорастущего ячменя, и мягкой пшеницы одновременно. Такая же картина наблюдалась при использования зонда atp6-rps13 в сочетании с рестриктазой HindIII (рис. 4).

Вторую группу составляют линии Л-31 и Л-36. Во всех случаях у них было обнаружено присутствие митохондриальных фрагментов блот-гибридизации только сортов мягкой пшеницы, соответственно Пиротрикс 28 и Новосибирская 67, участвующих в создании этих линий.

Таким образом, RFLP-анализ оказался подходящим для изучения типов митохондриальных локусов у аллоплазматических линий мягкой пшеницы. В дальнейшем исследование было расширено за счет введения дополнительного растительного материала и применения метода ПЦР-анализа 18S/5S рекомбинационного повтора мтДНК.



Рис. 4. Спектр блот-гибридизации

с митохондриальным зондом



atp6-rps13, полученный при обработке тотальной ДНК эндонуклеазой рестрикции Hind III

1 – H.marinum subsp. gussoneanum,

2 – Пиротрикс 28, 3 – Новосибирская 67, 4 – Л-29, 5 – 31, 5 – Л-26, 7 – Л-27,

8 – Л-36. Цифрами указана длина фрагментов в пн.




1 2 3 4 5 6 7 8


1000


700


ПЦР - анализ 18S/5S рекомбинационного повтора мтДНК

С целью определения родительского типа митохондриальных последовательностей у аллоплазматических линий мягкой пшеницы использована пара специфических ПЦР-праймеров к участку, фланкирующему 5' конец 18S/5S рекомбинационного повтора мтДНК злаков, для которого, как показано в литературе, характерна высокая вариабельность в семействе Graminaceae (Coulthart et al., 1993). Предварительный сравнительный ПЦР-анализ ячменя (H.mar) и мягкой пшеницы показал, что длины полученных фрагментов амплификации у этих видов отличаются на 50 п.н (рис. 5). Таким образом, различия, выявляемые у родительских видов при ПЦР участка 18S/5S локуса, дали возможность проанализировать присутствие того или иного типа данной последовательности у аллоплазматических линий (H.marinum subsp. gussoneanum)-T.aestivum.


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17





Рис. 5. ПЦР - спектр, полученный при амплификации 5’ конца

18S/5S рекомбинационного повтора митохондриальной ДНК.


Обозначения: 1 - ячмень H.marinum subsp. gussoneanum, 2 - пшеница

T.aestivum Пиротрикс 28, 3 - пшеница T.aestivum Новосибирская 67,

4 – Л-29, 5 – Л-31, 7 - линия 26, 8 – Л-27, 9 – Л-36, 10 – 218(1), 11 – 218(2),

12 – 218(3), 13 – 218(7), 14 – 218(9), 15 – 218(11), 16 – 218(12), 17 – 218(14).
При амплификации района 18S/5S мтДНК было обнаружено, что ПЦР-спектры линий Л-29, Л-49, Л-26, Л-27, Л-35, Л-38 и Л-503 содержат одновременно фрагменты как ячменя (H.mar), так и сортов мягкой пшеницы, включенных в создание ячменно-пшеничных гибридов в качестве материнского и отцовского родителей, соответственно. В спектрах линий Л-31 и Л-36 наблюдались только фрагменты амплификации пшеницы, а у линии Л-32 – только ячменя. Среди потомков растений группы 218 были обнаружены разные типы митохондриальных последовательностей: гетероплазмия, то есть присутствие фрагментов амплификации митохондриальных геномов ячменя и пшеницы у потомков растений 218(3), 218(7), 218(9), 218(12), 218(14); фрагмент амплификации генома пшеницы у потомков растений 218(1) и 218(2); фрагмент амплификации генома ячменя у потомков растения 218(11).

При сравнении результатов ПЦР-анализа локуса 18S/5S мтДНК с данными, полученными при RFLP-анализе трех других локусов пяти линий (Л-29, Л-31, Л-26, Л-27, Л-36) обнаружены следующие закономерности. Во всех изученных случаях у линий Л-31 и Л-36 наблюдались митохондриальные последовательности только отцовского, то есть пшеничного типа; у линий Л-29, Л-26 и Л-27 при RFLP-анализе были обнаружены либо материнские ячменные последовательности, либо гетероплазмия, при ПЦР-анализе 18S/5S локуса – только гетероплазмия. Необходимо отметить, что растения линии Л-32 и потомки растения 218(11), у которых при анализе 18S/5S локуса были обнаружены митохондриальные последовательности только материнского ячменного типа, в в последующих самоопыленных поколениях проявили практически полную стерильность.

Сопоставление результатов изучения ядерных и митохондриальных геномов аллпоплазматических линий позволило выявить взаимосвязь между между присутствием последовательностей мтДНК определенного родительского типа, наличием хромосом ячменя в ядерном геноме аллоплазматических линий и проявлением фертильности растений.

ВЫВОДЫ

1. Впервые с применением RAPD-анализа охарактеризованы ядерные геномы аллоплазматических эуплоидных и анеуплоидных линий (H. marinum subsp. gussoneanum)-T. aestivum разного происхождения и показано, что формирование этих линий сопровождается встраиванием в геном мягкой пшеницы фрагментов генома дикорастущего ячменя.

2. На основании результатов геномной in situ гибридизации установлено, что аллоплазматические эуплоидные линии (H. marinum subsp. gussoneanum)-T. aestivum представлены тремя вариантами: с замещением трех пар хромосом мягкой пшеницы на три пары хромосом ячменя (2n = 36w + 6b), с замещением пары хромосом мягкой пшеницы на пару хромосом ячменя (2n = 40w + 2b), не содержащие хромосом дикорастущего ячменя (2n = 42w) (w – wheat, b – barley). Показано, что у анеуплоидных линий (H.marinum subsp. gussoneanum)-T. aestivum присутствуют телоцентрические хромосомы ячменя (2n=40w+2tb), (2n=42w+2tb) или телоцентрические хромосомы как ячменя, так и пшеницы (2n=40w+2tw+2tb).

3. Результаты SSR-анализа указывают на предпочтительное замещение хромосомы 7D на гомеологичные хромосомы ячменя H.marinum subsp. gussoneanum у самофертильных аллоплазматических эуплоидных линий (2n=40w+2b). У аллоплазматических анеуплоидных линий (2n=40w+2tw+2tb) две телоцентрические хромосомы соответствуют длинному плечу хромосомы мягкой пшеницы 7D.

4. Установлено, что определенный тип последовательностей мтДНК у аллоплазматических эуплоидных и анеуплоидных линий (H.marinum subsp. gussoneanum)-T. aestivum ассоциирует с проявлением фертильности растений и наличием хромосом ячменя в ядерном геноме:

 стабильно самофертильные аллоплазматические эуплоидные линии, не имеющие хромосом ячменя, по всем изученным локусам мтДНК содержали последовательности отцовского типа;

 у аллоплазматических замещенных и анеуплоидных линий мягкой пшеницы с пониженной фертильностью выявлена гетероплазмия (одновременное присутствие последовательностей и ячменного, и пшеничного типов) по митохондриальному локусу 18S/5S;

 стерильные и нежизнеспособные образцы аллоплазматических замещенных линий содержали последовательности ячменного типа митохондриального локуса 18S/5S.



СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Bildanova L.L., Troubacheeva N.V., Salina E.A., Pershina L.A. 2001. Molecular changes in the genome of backcrossed progenies of barley-wheat hybrids. EWAC Newsl. N 11: 92-94.

2. Бильданова Л.Л., Трубачеева Н.В., Песцова Е.Г., Щербань А.Б. 2001. Молекулярный анализ ретротранспозон-зависимых изменений в геномах ячменно-пшеничных гибридов. Конкурс молодых ученых СО РАН 1997-1998 гг. Биологические науки. Сборник трудов. Институт цитологии и генетики СО РАН, С.7-10.

3. Pershina L.A., Numerova O.M., Belova L.I., Devyatkina E.P., Bildanova L.L., Troubacheeva N.V., Salina E.A. 2001. Alloplasmic lines of wheat T.aestivum L. with cytoplasm of barley H.vulgare L. In: Genetic Collection, Isogenic and Alloplasmic Lines. Proc. Intern. Conf. July 30-August 3, 2001.- Novosibirsk. p. 98-100.

4. Трубачеева Н.В., Бильданова Л.Л. 2001. Характеристика генома аллоплазматических линий пшеницы с использованием RAPD - метода. Тезисы международной конференции молодых ученых «Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений», 2-7 июля 2001 г., Институт растениеводства им. В.Я.Юрьева Украинской Академии аграрных наук, Харьков. с.18-19.

5. Pershina L.A., Numerova O.M., Salina E.A., Bildanova L.L., Troubacheeva N.V., Shumny V.K. 2001. The study of barley-rye, barley-wheat hybrids and production different genotypes of alloplasmic lines of wheat using barley-wheat hybrids. Book of abstracts of 4th International Triticeae Symposium, Cordoba, Spain. p.122.

6. Трубачеева Н.В., Салина Е.А., Нумерова О.М., Першина Л.А. 2003. Изучение характера интрогрессии генетического материала ячменя в геноме аллоплазматических линий пшеницы H.geniculatum All./ T.aestivum L. с помощью RAPD-анализа. Генетика. Т.39. №6. c.791-795.

7. Трубачеева Н.В., Салина Е.А., Нумерова О.М., Першина Л.А. 2001. Изучение преобразования геномов в ряду поколений аллоплазматических линий пшеницы H.geniculatum All. x T.aestivum L. с помощью RAPD-анализа. Материалы 2-й конференции МОГиС “Актуальные проблемы генетики”, 20-21 февраля 2003 г., ИОГен РАН, Москва, с. 74.

8. Трубачеева Н.В., Салина Е.А., Нумерова О.М., Першина Л.А. 2003. Молекулярно-генетический анализ геномов потомков ячменно-пшеничных гибридов H.geniculatum All.(2n=28) x T.aestivum L. (2n=42) при формировании аллоплазматических линий пшеницы. Международная конференция по отдаленной гибридизации, 15-17 декабря 2003 г., Москва, с.292.

9. Трубачеева Н.В., Нумерова О.М., Салина Е.А. 2004. Характеристика ядерного и митохондриального геномов беккроссных потомков ячменно-пшеничных гибридов H.geniculatum All.(2n=28)/T.aestivum L. (2n=42). Материалы III съезда ВОГиС Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития, 6-12 июня 2004 года, Москва. Т.1, с.292.

10. Трубачеева Н.В., Салина Е.А., Першина Л.А. 2005. Изучение митохондриальных геномов аллоплазматических рекомбинантных линий пшеницы, полученных на основе ячменно-пшеничных гибридов H. geniculatum All. (=H.marinum subsp. gussoneanum) (2n=28) x T.aestivum L. (2n=42), при использованиии RFLP- и ПЦР- анализа. Генетика. Т.41. №3. с.1-6.

11. Першина Л.А., Адонина И.Г., Арбузова В.С., Белова Л.И., Бильданова Л.Л., Будашкина Е.Б., Девяткина Э.П., Добровольская О.Б., Ефремова Т.Т., Калинина Н.П., Кравцова Л.А., Лайкова Л.И., Леонова И.Н., Раковцева Т.С., Салина Е.А., Силкова О.Г., Трубачеева Н.В., Хлесткина Е.К., Щапова А.И., Щербань А.Б., Шумный В.К. 2005. Использование молекулярно-генетических подходов и методов хромосомной инженерии для изучения и увеличения генетического разнообразия мягкой пшеницы. Отчетная конференция «Динамика генофондов растений, животных и человека». Москва, РАН, Программа фундаментальных исследований. с. 83-86.

12. Трубачеева Н.В., Адонина И.Г., Салина Е.А., Першина Л.А. 2005. Молекулярно-генетический и GISH – анализ геномов аллоплазматических рекомбинантных линий мягкой пшеницы [H. geniculatum All. (=H.marinum subsp. gussoneanum) (2n=28)-T.aestivum L. (2n=42)]. Тезисы докладов и стендовых сообщений V Международного совещания и Школы молодых ученых по кариологии, кариосистематике и молекулярной систематике растений, Санкт- Петербург, 12-15 октября 2005 г., с.101-102.

13. Першина Л.А. Трубачеева Н.В., Раковцева Т.С., Белова Л.И., Девяткина Э.П., Кравцова Л.А. 2006. Особенности формирования самофертильных эуплоидных линий (2n=42) в результате самоопыления 46-хромосомных беккроссных потомков BC1-поколения ячменно-пшеничных гибридов H.geniculatum All. (=H.marinum subsp. gussoneanum) (2n=28) x T.aestivum L. (2n=42). Генетика. Т.42. №12. с.1683-1690.

14. Трубачеева Н.В., Салина Е.А., Першина Л.А. 2006. Особенности проявления гетероплазмии митохондриальной ДНК у беккроссных потомков ячменно-пшеничных гибридов H.marinum subsp. gussoneanum (=H.geniculatum All.) (2n=28) х T.aestivum L. (2n=42). Всероссийской научной конференции ”Структура и экспрессия митохондриального генома растений”, Иркутск, 3-7 сентября 2006 г., с. 112-116.

15. Трубачеева Н.В., Бадаева Е.Д., Адонина И.Г., Белова Л.И., Девяткина Э.П., Першина Л.А. 2007. Получение и изучение с применением комплекса методов молекулярного и цитогенетического анализа аллоплазматических эуплоидных (2n=42) и телоцентрически дополненных линий (2n=42+2t) (Hordeum marinum subsp. gussoneanum)-Triticum aestivum. Генетика. 2007. В печати.





Verilənlər bazası müəlliflik hüququ ilə müdafiə olunur ©kagiz.org 2016
rəhbərliyinə müraciət