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Cloning, expression and function of phosphate transporter encoded gene in Oryza sativa L


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全国植物分子育种研讨会摘要集

水稻磷酸盐转运蛋白基因的克隆、表达及功能分析

明凤12,张璇12,张佰隆12,路群12, 王伟12


(1.复旦大学生命科学学院 遗传学研究所 遗传工程国家重点实验室; 2. 复旦大学生命科学学院 植物科学研究所 上海 20043)
我国有2/3 的耕地缺磷,尤以南方酸性土壤缺磷为重.我国最主要的粮食作物水稻,90%播种面积分布于南方地区,磷素短缺限制了产量,加上与日俱增的人口与粮食危机,提高水稻产量势在必行。低磷下根系磷酸盐转运蛋白表达强弱与耐逆性有很大的相关.本研究力求对磷胁迫下与磷酸盐吸收有关的主效基因进行分离,在获得此编码磷酸盐转运蛋白基因的全序列基础上,对其功能、表达与调控等方面进行研究,以明确该基因在植物耐低磷反应中的具体作用,进而人为调控增强水稻适应逆境。获得有知识产权主效目的基因,通过此基因定向改良品种,适应低磷养分逆境。本研究具有一定的理论与应用价值。初步研究结果为:建立了滴度为2×108pfu/ml 水稻京系17 的扩增文库;分离并登录了水稻磷酸盐转运蛋白编码基因的ORF 区(OrLPT1,后命名为OsPT6:1),在水稻基因组中以多基因家族存在。在器官水平上为组成型表达模式,根系与叶片都有表达,根系具有较明显的磷素依赖型增进表达,并随着磷素处理时间与恢复供磷表达发生明显的变化。组织水平上,缺磷处理的叶片中的表达信号主要集中在叶肉细胞、维管束和木质部薄壁组织细胞中;在正常磷素供给下,仅表达在木质部薄壁组织细胞中;对于根系,缺磷处理下表达信号多集中在表皮与皮层,而在正常培养下,只有微弱的表达信号。该基因的表达方式说明了此基因可能参与根系的吸收与叶片的磷素转移功能。通过同源重组方法将目的基因转化到野生酵母菌株、功能互补酵母突变体;农杆菌侵染方法转化到水稻愈伤组织中,目的基因表达蛋白均促进了宿主对磷素的吸收能力。通过本项目的研究,对其功能、表达与调控等方面进行了揭示,明确该基因在植物耐低磷反应中的具体作用,是理论研究基础的创新。通过此基因定向改良品种,适应低磷养分逆境,将会有广阔的应用前景。
Cloning, expression and function of phosphate transporter encoded gene in Oryza sativa L.

普通小麦低分子量谷蛋白亚基基因克隆与功能标记的开发

王林海,何中虎*,夏先春


(中国农业科学院作物科学研究所,国家小麦改良中心,北京市中关村南大街12号,北京100081)
麦谷蛋白对小麦的加工品质有着重要影响,低分子量麦谷蛋白(LMW-GS)是麦谷蛋白的重要组成部分,其编码基因主要位于Glu-3位点,分别由Glu-A3Glu-B3Glu-D3编码。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是鉴定LMW-GS的传统方法,但LMW-GS基因拷贝较多,分子量与醇溶蛋白相近,在SDS-PAGE 图谱上易与醇溶蛋白重叠在一起,因而难以区分。为建立快速、准确、有效的鉴别不同LMW-GS的分子标记辅助选择体系,本研究根据GenBank上注册的LMW-GS基因序列,通过比对分析,设计了Glu-B3基因特异性引物,通过PCR方法获得4个Glu-B3基因GluB3-1GluB3-2GluB3-3GluB3-4,共17个等位变异,全部包含完整的编码区域。4个基因的推测氨基酸序列BP1、BP2、BP3和BP4均具有典型的LMW-GS基因特征,包括一个高度保守的含20个氨基酸的信号肽区、含13个氨基酸的N 末端保守区,其后是N末端重复区和C末端保守区,以及8个半胱氨酸残基。BP1、BP2和BP3的序列长度分别为343-360、369-370和392个氨基酸,分子量变化在-39.0 kDa (BP1-5) 至 -44.6 kDa (BP3-1) 之间,它们的N-末端序列都是MENSHIP;BP3的序列长度为343-350个氨基酸,分子量为-39.0 kDa (BP4-5) 或-39.8 kDa (BP4-1,BP4-2, BP4-3 和 BP4-4),其N-末端序列为METSHIP。根据不同基因等位变异间的差异,开发了10个能够区分Glu-B3abcdefghi的功能标记,分别命名为gluB3agluB3bgluB3cgluB3dgluB3egluB3ggluB3hgluB3igluB3fggluB3bef,其中,在区分Glu-B3f时,需要标记gluB3fggluB3bef与相关的标记组合起来应用。利用这10个标记对161份经SDS-PAGE鉴定的材料进行分析,结果表明,分子标记的检测结果与SDS-PAGE的结果吻合率达96%,说明所开发的标记能够应用于分子标记辅助选择育种。

为进一步了解编码Glu-A3基因的组成特点,建立方便、有效的分子标记辅助选择体系,参照Glu-B3基因的研究方法,最终获得3个Glu-A3基因,分别命名为GluA3-1GluA3-2GluA3-3GluA3-1含有GluA3-11 GluA3-12 GluA3-13 GluA3-14GluA3-15GluA3-16GluA3-17等7个等位变异;GluA3-2含有GluA3-21GluA3-22 GluA3-23GluA3-24共4个等位变异;GluA3-3含有6个等位变异,分别为:GluA3-31 GluA3-32GluA3-33 GluA3-34GluA3-35GluA3-36。其中,基因GluA3-1的全部等位变异和GluA3-2GluA3-23GluA3-24各包含一个完整的开放阅读框,因而能够编码低分子量麦谷蛋白,而其它的等位变异为假基因。根据等位变异之间的差异,针对不同的Glu-A3亚基,设计了gluB3agluB3bgluB3acgluB3dgluB3egluB3fgluB3g等7对STS标记。为进一步降低检测成本,提高效率,构建了能够同时检测Glu-A3bfGlu-A3beGlu-A3dfGlu-A3dg的多重PCR体系。利用这些标记检测了141份经SDS-PAGE鉴定CIMMYT材料,结果表明其能够有效地应用于分子标记辅助选择。



Characterization of low-molecular-weight glutenin subunit genes and development of functional markers in common wheat (Triticum aestivum L.)

小麦多酚氧化酶和八氢番茄红素合成酶基因的表达机理研究

孙友位,何心尧,何中虎*,夏先春


(中国农业科学院作物科学研究所,国家小麦改良中心,北京市中关村南大街12号,北京100081)
小麦籽粒多酚氧化酶(Polyphenol oxidase, PPO)活性和黄色素含量对面粉及面制品的表观色泽具有重要影响,研究PPO活性和黄色素含量相关基因的表达机理,揭示面制品颜色形成的分子机制,能够为小麦颜色品质改良提供理论依据。

籽粒PPO活性是面制品色泽褐变的主要影响因素。本研究应用半定量RT-PCR技术,分析了8个普通小麦品种2A和2D染色体上PPO活性基因Ppo-A1Ppo-D1在籽粒和叶片中不同发育时期的表达谱,分别获得了Ppo-A1aPpo-A1bPpo-D1aPpo-D1b等位基因的cDNA序列。Ppo-A1aPpo-A1b等位基因的cDNA序列均含有1731bp的编码区,含有6个SNP位点;Ppo-D1aPpo-D1b等位基因的cDNA均含有1731bp的编码区,并含有81个SNP位点根据Ppo-A1基因cDNA序列编码区和3’UTR区序列设计特异引物PPO2检测8个不同的普通小麦品种的cDNA,仅在籽粒中检测到而在叶片中检测不到Ppo-A1基因的表达。Ppo-A1基因在籽粒发育早期(7d)表达量低,籽粒发育过程中(开花后14-28d)表达水平高,随着籽粒的成熟(35d)表达水平迅速下降。Ppo-A1基因的表达水平与不同小麦品种成熟籽粒的PPO活性呈正相关。Ppo-A1a等位基因的表达水平显著高于Ppo-A1b等位基因,推测Ppo-A1b等位基因第一内含子处191bp插入片段有可能影响了该基因的表达水平。Ppo-D1b等位基因开花后7d时表达量低,籽粒发育过程中(开花后14-21d)具有较高的表达水平,随着籽粒的成熟(28-35d)其表达水平迅速下降;Ppo-D1a等位基因开花后7d时具有较高的表达水平,随着籽粒的发育和成熟其表达水平迅速降低。Ppo-D1b基因的表达水平在籽粒发育早期(7d)显著低于Ppo-D1a基因的表达,而在籽粒发育过程中(开花后14-28d)显著高于Ppo-D1a基因的表达。

八氢番茄红素合成酶(Phytoene synthase,PSY)是小麦籽粒类胡萝卜素合成途径中上游的一个关键限速酶。本研究应用半定量RT-PCR技术,分析了9个普通小麦品种7A染色体上PSY-A1基因在籽粒不同发育时期的表达谱,并获得了PSY-A1aPSY-A1b等位基因的cDNA序列。PSY-A1aPSY-A1b基因的cDNA序列均含有长度为1284bp,序列完全一致的编码区PSY-A1基因在籽粒发育早期(7d)表达水平最高,籽粒发育(14-28d)过程中迅速降低,随着籽粒的成熟(35d)其表达水平有所上升,这与其合成途径中限速酶作用特性相一致。在籽粒发育的不同时期,PSY-A1a等位基因表达水平均显著高于PSY-A1b等位基因的表达水平,推测PSY-A1b等位基因第二内含子区37bp的插入序列影响了该基因的正常表达,但仍有低丰度的表达量,表明PSY-A1b基因的完全缺失表达可能致死。

Characterization of the expression of polyphenol oxidase and phytoene synthase genes in common wheat

花生Δ12脂肪酸脱氢酶与高油酸性状的关系

潘丽娟,杨庆利,禹山林


(山东省农科院花生研究所,中国青岛,266100)
花生是我国主要的油料和经济作物之一,是食用植物油和蛋白质的重要来源。我国花生播种面积仅次于印度而居全球第二位,总产量、总消费量和出口量均居世界首位,在全球花生生产中的地位举足轻重。花生仁中含有脂肪50%左右,其中大约80%由油酸和亚油酸组成。油酸在人体的脂类代谢中发挥着特殊的作用,它可以降低有害胆固醇(低密度脂蛋白,LDL),但保持有益胆固醇(高密度脂蛋白,HDL)的水平,从而减缓动脉粥样硬化,有效预防冠心病等心血管疾病的发生。而亚油酸为多不饱和脂肪酸,虽能降低有害胆固醇但也能降低有益胆固醇的含量,因而对健康不利。而且油酸与亚油酸比值的高低决定了花生的品质性状。油酸与亚油酸的比值高,抗氧化能力就强,在夏季高温的情况下不易氧化酸败,货架周期较长,耐储能力也较强。因此,油酸含量高的花生品种具有更好的商品性。提高油酸的相对含量,增加油酸/亚油酸(O/L)的比值,成为目前花生品质改良育种的研究重点。

本研究比较了辐射育种获得的高油酸花生品系(O/L比值约40)与普通花生品系中的△12脂肪酸脱氢酶基因的序列差异。Δ12脂肪酸脱氢酶基因是控制花生籽仁高油酸性状的候选基因。本文采用RT-PCR方法结合RACE技术,分别从普通花生和高油酸含量花生材料中获得了Δ12脂肪酸脱氢酶基因的全长cDNA序列,命名为AhFAD2BAhFAD2B'。分析两个基因的编码区序列发现,AhFAD2B' 基因序列在起始密码子后第442 bp处有碱基A的插入,导致编码区提前终止,编码一个截短蛋白AhFAD2B',丢失了一个膜结合蛋白保守的组氨酸框。转录水平的表达分析显示,Δ12脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2B在高油酸花生材料中的表达量明显低于普通花生中的表达量。

为了验证普通花生与高油酸花生中Δ12 脂肪酸脱氢酶的功能异同,利用酿酒酵母营养缺陷型INVSc1为受体菌,pYES2为表达载体,进行基因功能验证。结果表明,AhFAD2B基因编码的蛋白在酿酒酵母中获得表达,具有Δ12 脂肪酸脱氢酶的活性,菌株中产生了C18:2△9,12亚油酸。而转化空载体pYES2和pYFAD2B’重组质粒的酵母菌株中未能检测到C18:2△9,12亚油酸。结果表明,AhFAD2B’ 基因编码的酶蛋白没有显示脂肪酸脱氢酶活性。这些结果都显示Δ12 脂肪酸脱氢酶基因是调控花生油酸含量的主要因素。因此,可以通过利用抑制花生中AhFAD2B基因的表达来提高花生油酸的含量。本研究结果为进一步利用基因工程手段改良花生脂肪酸组分提供了理论基础。

The relation of the Δ12 fatty acid desaturase with the high oleate trait in peanut (Arachis hypogaea L.)

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